2020版藥典中新增的多維液相色譜究竟是“何方神圣”？

2020版藥典液相色譜法中新增了多維液相色譜，各位不了解的小伙伴快來看看吧

一維液相色譜的劣勢

色譜作為復雜混合物的分離工具，對化合物的分離分析發揮了很大的作用。目前使用的大多數儀器為一維色譜，使用一根柱子，適合于含幾十至幾百個物質的樣品分析。當樣品更復雜時，例如有人分析鹿茸蛋白，得到上千個色譜峰，可是經質譜定性表明，平均每個峰又含有二個組分，就要用到多維色譜技術。

多維液相色譜的優勢

多維液相色譜又稱為色譜/色譜聯用技術，是采用匹配的接口將不同分離性能或特點的色譜連接起來，di一級色譜中未分離或需要分離富集的組分由接口轉移到第二級色譜中，第二級色譜仍需進一步分離或分離富集的組分，也可以繼續通過接口轉移到第三級色譜中。

理論上，可以通過接口將任意級色譜串聯或并聯起來，直至將混合物樣品中所有的難分離、需富集的組分都分離或富集之。但實際上，一般只要選用兩個合適的色譜聯用就可以滿足絕大多數難分離混合物樣品的分離或富集要求。因此，一般的色譜/色譜聯用都是二級，即二維色譜。

圖1、二維液相色譜示意圖

二維液相色譜分類

在二維色譜的術語中，1D和2D分別指一維和二維；而¹D和²D則分別代表di一維和第二維。

二維液相色譜可以分為差異顯著的兩種類型。若兩種色譜的聯用僅是通過接口將前一級色譜中某一些組分傳遞到后一級色譜中繼續分離，這是中心切割式二維色譜(heart-cuttingmode two-dimensional chromatography)，一般用(LC-LC)表示。當兩種色譜聯用，接口將前一級色譜中的全部組分連續地傳遞到后一級色譜中進行分離，這種二維色譜稱為全二維色譜(comprehensive two-dimensional chromatograghy)一般用LC×LC表示。

LC×LC是將¹D色譜柱的流出物連續轉移至²D色譜柱。相比之下，LC-LC則是將¹D流出物選擇性地（部分地）轉移至²D色譜柱中。此外，這兩種類型下還有若干子類，包括選擇性二維色譜(sLC×LC)和多中心切割²D-LC(mLC-LC)。

LC-LC或LC×LC兩種二維色譜可以是相同的分離模式和類型，也可以是不同的分離模式和類型。接口技術是實現二維色譜分離的關鍵之一，原則上，只要有匹配的接口，任何模式和類型的色譜都可以聯用。

和一維色譜一樣，二維色譜也可以和質譜、紅外和核磁共振等聯用。

SCX/RP二維液相色譜用于珠蛋白酶解產物分析

圖2、 SCX/RP高通量分析珠蛋白酶解產物

??di一維采用SCX強陽離子交換色譜柱，流動相A為5mM NaH2PO4+1%乙腈，B為A+1.0mol/L NH4Cl，流動相pH4.0。

??第二維采用兩支相同的C18常規反相色譜柱，流動相A為含0.1%TFA的水溶液，B為含0.1%TFA的乙腈。

樣品進入陽離子交換色譜，由SCX流動相逐步增加鹽濃度間斷洗脫，通過接口的有效轉移將SCX洗脫的產物導入第二維反相色譜中進一步分離。

在選定實驗條件下的二維分析結果，在離子交換色譜和反相色譜構成的二維液相色譜系統中，因離子交換色譜較高的柱容量通常作為di一維系統，而反相色譜與離子交換色譜流動相有較好的兼容性及較高的分辨率常作為第二維系統。

由于SCX對樣品的切割分離，二維分離的結果大大降低了樣品分析的復雜性。同時由于二維分離機理的正交性，進一步拓寬了樣品的分離空間，增強了系統的分離能力。在分析珠蛋白酶解產物中，di一維離子交換切割次數為19次，由圖2可知第二維反相色譜峰容量為174，這種臺階式洗脫切割方法峰容量為di一維切割次數乘以第二維峰容量，因此SCX/RP二維液相色譜的峰容量可達到3306。