液相色譜，你問我答（一）

#1 相對于氣相色譜，液相的優勢在哪里？

答：液相和氣相相比的優勢有很多，主要在于應用范圍更廣。氣相只限于容易氣化的低分子量物質的分析測定，對象大部分是基礎化工原材料；而任何能溶解于某溶劑的物質都能用液相分析，適用對象是分子量從幾十到幾萬的廣大范圍。在制藥、化工、環保、食品等諸多重要領域，液相都已成為主導的分析工具。也有兩者都能應用的交叉情況，但液相的制樣更簡單。液相色譜的出現克服了氣相色譜不能直接用于難揮發、熱不穩定及高分子化合物的弱點。

#2 經常有客戶疑惑，柱子是否可以反沖？

什么樣的柱子可以反沖？什么不可以？

反沖后是正著用，還是反著用？

答：一般的正相反相柱應該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖，不過目前這樣的柱子已經比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染。月旭的絕大多數色譜柱都是可以反沖，并且我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗。

#3 有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑（2～5μm）的前篩板，這種情況反沖會將填料沖出。那么，在使用說明書中會說明前后篩板的孔徑嗎？

答：如果前后篩板孔徑不對稱，廠商肯定也會在說明書里特別提到的。月旭科技的色譜柱前后篩板孔徑都是對稱的。

#4 反沖的時候要接檢測器嗎？

答：反沖就是將柱子反向連到系統中，理論上接不接檢測器都可以，不過，若樣品的確比較臟，污染物比較多的情況，建議不接檢測器，直接出口端放空接廢液瓶。因為有污染物沖出來，連檢測器容易造成檢測器的污染。

#5 用離子交換柱做方法開發的時候，用乙腈和水作為流動相，在調整梯度的時候發現，剛開始用60%乙腈，RT為2.5分鐘，調到40%乙腈，RT沒有變化，30%也沒有變化，一直調到20%的時候，RT突然變到了約13分鐘，請問這是什么原因？

答：離子交換柱的保留機理主要是靜電相互作用力，影響因素主要有離子強度和pH，此外還有氫鍵等次級作用力，甚至分子排阻作用也可能存在，因而離子交換色譜中，保留機理并非像反相色譜那樣簡單，更不是單純的跟有機相的比例呈正相關，需要考慮是否水相比例增大導致了流動相離子強度的改變，或增大了氫鍵作用力等。此外，離子交換色譜柱的基質是硅膠還是聚合物也有不同的影響。

#6 對于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的時候應該怎樣進行活化及維護？為什么要這樣做？

答：新柱活化，實際上是一個平衡的過程，色譜柱在運輸和儲存過程中，有可能出現柱內溶劑揮發的情況，導致填料干掉，鍵合相得不到充分潤濕，因此需要活化。月旭色譜柱按照說明書活化方式活化即可。除了用流動相平衡外，有時候還必須用所測樣品對新柱進行平衡，具體平衡方式也很簡單，把前面用來平衡的進樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續進樣多針。用待測物對新柱平衡，目的是：將硅膠基質填料表面具有非特異性吸附的位點的吸附能力飽和掉。

#7 C18柱會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，這樣做的目的是什么呢？

答：C18柱會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，因為，色譜柱到達用戶手中時，時間長短不一，在存儲和運輸的過程中，可能存儲液有些揮發，低流速的甲醇可以很好的浸潤固定相，使鍵合相很好的伸展，用溶劑平衡好系統后，可以采取多次進樣或者加大進樣量的方式以更快的獲得重現的色譜圖，這樣用樣品將色譜柱中的活性位點飽和，就不會出現異常色譜現象的情況。

#8 我前幾天剛剛裝上一個新的C18柱，在進樣之前我用100%的甲醇沖了半個多小時。剛才看到上面寫的要活化什么的？不知道我只沖洗半小時就開始用對柱子有沒有影響？對出峰什么的有沒有影響呢？

答：首先，若僅僅是新柱活化，建議嚴格按照廠家色譜柱說明書的操作進行；其次，樣品老化，不是所有的測定，都需要對新柱子用所測樣品老化。但先按方法程序進樣幾針，觀察到峰面積保留時間不再有明顯變化，再開始正式測定，這是一個好習慣。

#9 測定多肽，一般采用什么柱子？流動相是乙腈和水，還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽，應該怎么選擇柱子？

答：分子量不高的多肽一般選用常規C18或C8柱就能測定，也有用離子交換柱、水性柱和HILIC親水作用柱的。若流動相中含有三lv乙酸這類酸性添加劑，建議還是使用耐受低pH的色譜柱，如月旭科技Ultimate® LP系列。

#10 氨基柱在進酸性樣品時，很傷柱子，如使用一段時間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復？

答：氨基柱測酸性樣品，應該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負電荷的氨基官能團質子化，導致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質有所改變或表現在柱效下降。建議：用5～10倍的柱體積的含0.5～1.0％NH3的乙腈/水(50/50)溶液沖洗該柱（沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨），之后，再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨，如0.05％。