反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾。究其原因，是硅膠表面殘留硅羥基對極性和堿性樣品分子產(chǎn)生的次級保留效應(yīng)（前提：排除色譜柱問題和樣品過載問題）。

峰形優(yōu)化實(shí)例分析

-分析物的部分結(jié)構(gòu)-

1、初始方法

以0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含0.5%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5）-甲醇（49∶51）為流動相；檢測波長為210nm；某未知品牌C18柱；初始結(jié)果：峰拖尾，峰寬5min，無法出尖峰。需要做方法優(yōu)化，達(dá)到峰形對稱。

2、拖尾原因分析

反相填料表面有殘余的硅羥基，具有一定的酸性，其pKa約為4.5～4.7。根據(jù)電離規(guī)律，當(dāng)流動相的pH-pKa>2即pH>6.7時(shí)，99％以上的硅羥基應(yīng)是呈離子狀態(tài)的，即Si-O- 。

而當(dāng)pKa-pH>2即pH<2.5時(shí)，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99％以上的硅羥基應(yīng)是呈分子狀態(tài)的，即Si-OH，但其極性仍然存在，為Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-對于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強(qiáng)得多。

同時(shí)，因?yàn)楣枘z表面鍵合了C18長鏈，由于空間位阻作用，樣品分子能接觸到殘余硅羥基的機(jī)會不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強(qiáng)的靜電作用而被推遲洗脫出來，峰形拖尾。

3、優(yōu)化方向

抑制硅膠上殘余硅羥基與分析物之間的作用，減弱次級吸附作用。

● 減少硅膠上殘余硅羥基或減少與分析物間發(fā)生作用的殘余硅羥基，占據(jù)硅羥基這個(gè)作用位點(diǎn)。比如，使用徹di封端的色譜柱；在流動相中添加三乙胺（TEA）、四丁基硫酸氫銨等作為減尾劑，競爭殘留硅羥基；調(diào)節(jié)流動相pH。

● 減少與殘余硅羥基發(fā)生作用的分析物離子，占據(jù)-NH2、-NHR、-NR2這些分析物作用位點(diǎn)。比如，加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對試劑。

● 干擾殘余硅羥基與分析物間的相互作用。比如加入緩沖鹽，增強(qiáng)流動相的離子強(qiáng)度。

4、優(yōu)化過程

#01、選擇合適的高純硅膠徹di封端色譜柱：Blossmate® Polar RP（4.6*300mm，5μm）。

分析：峰拖尾，峰寬2min，優(yōu)于初始條件的結(jié)果。拖尾的嚴(yán)重程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同。從填料合成的角度而言就是：鍵合密度是否高、封尾是否徹di。高密鍵合和徹di的封尾能顯著減少靜電作用機(jī)會，獲得良好的峰形。月旭科技Ultimate®系列XB-C18、AQ-C18、Blossmate®系列Polar RP和Xtimate®系列C18采取的就是高密鍵合和徹di的雙峰尾工藝。

#02、降低流動相pH：改為2.5，后續(xù)一直使用Blossmate® Polar RP色譜柱。

分析：酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，拖尾稍有改善，但不明顯，pH對峰形改善作用較小。

#03、水相添加磷酸二氫鉀，減小庚烷磺酸鈉濃度，流動相改為：0.01mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）-甲醇（49∶51）

分析：流動相中緩沖鹽爆發(fā)出力挽狂瀾的氣勢，峰拖尾現(xiàn)象變成峰前延。

#04、恢復(fù)庚烷磺酸鈉濃度，流動相改為：0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾，比不加磷酸鹽時(shí)峰形好。根據(jù)3和4的結(jié)果可以推斷：在0.01mol/L 至0.02mol/L之間范圍濃度的庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）-甲醇（49∶51）可以使得峰形對稱。

#05、流動相改為：0.015mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺， pH 2.8）-甲醇（49∶51）。

分析：拖尾改善，峰形較好。可以看出，調(diào)整庚烷磺酸鈉濃度對峰形的改善作用較大。

#06、流動相改為：0.015mol/L庚烷磺酸鈉溶液（0.5%三乙胺， pH2.9）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾。可以發(fā)現(xiàn)，在沒有磷酸二氫鉀存在的情況下，同時(shí)改變庚烷磺酸鈉和pH，與1的結(jié)果比較，峰形雖有改善，不對稱由3.38變?yōu)?.13，作用不大。流動相中磷酸二氫鉀的存在具有決定性作用。

#07、主要通過調(diào)整流動相中庚烷磺酸鈉濃度來改善峰形，流動相改為：0.0125mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺， pH 3.1）-甲醇（49∶51）。

分析：峰前延。

#08、增加庚烷磺酸鈉濃度，流動相改為：0.0138mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺， pH3.14）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾因子1.24。后續(xù)只需微調(diào)庚烷磺酸鈉濃度于0.0125-0.0138mol/L（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，微調(diào)pH約至2.5），可進(jìn)一步優(yōu)化峰形。

#01、相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同，高密鍵合和徹di的封尾能顯著減少靜電作用機(jī)會，獲得良好的峰形。

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#02、流動相中加入磺酸鹽離子對試劑能與樣品分子作用，從而阻止樣品分子與殘留硅羥基發(fā)生次級吸附作用，進(jìn)而改善峰形及增加保留。一般加入0.003-0.01mol/L濃度。

#03、流動相中加入緩沖鹽，增強(qiáng)了流動相的離子強(qiáng)度，在-NH3+等極性基團(tuán)和硅羥基Si-O-之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機(jī)會，有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。

#04、加入三乙胺作為減尾劑改善峰形的時(shí)候，有兩點(diǎn)需要注意：

● 三乙胺的堿性很強(qiáng)，加入三乙胺后流動相的pH可能超出色譜柱的使用范圍，對色譜柱造成損傷。pH的改變也會導(dǎo)致出峰時(shí)間的顯著變化，可能引起的其它問題，建議流動相中加入三乙胺后回調(diào)至未加入前的pH值。通常即使pH回調(diào)過后，由于三乙胺成為了固定相的一部分，保留時(shí)間也有較大變化；

● 三乙胺在210nm處有一定的吸收，如果液相方法中檢測波長在210nm以下測定時(shí)需要謹(jǐn)慎使用。四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離后，也形成了類似N+H(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N+(CH2CH2CH2CH3)4，這種結(jié)構(gòu)也能有效的與Si-O-產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用，阻止氨基與硅羥基的接觸，改善峰形。而且它還有一個(gè)不同于三乙胺的顯著特點(diǎn)是，在低波長范圍其紫外吸收比三乙胺弱，檢測波長在210nm以下測定時(shí)可選擇使用。

● 酸性化合物拖尾需要降低流動相的pH值，盡量使酸質(zhì)子化；可以通過向流動相中加入競爭的有機(jī)酸得到較好結(jié)果，如使用0.1%三氟yi酸 (TFA) ，并且這種添加劑具有比較低的紫外截止波長。

參考資料：食品伙伴網(wǎng)