學會這個多條路——離子排阻色譜的原理與實戰！

什么是離子排阻色譜？

離子排阻色譜又叫作離子排阻分配色譜，離子節制分配色譜。離子排阻色譜分離測定的是低電離度的分子，而不是離子，分離過程在離子交換柱上實現。

離子交換柱

色譜柱作為分離機制中重要的一員，承擔著固定相的角色，是我們必須了解的重點！

本文暫且以月旭Xtimate^® Sugar-H柱為例，來闡述分離原理。該色譜柱采用磺化苯乙烯二乙烯基苯共聚氫型強陽離子交換填料，交聯度8%，具有耐酸、耐高溫的特點。樹脂中二乙烯基苯的含量影響弱酸的保留，一般而言，交聯度越低，就有越多的電解質進入到樹脂內部，使弱酸的保留增強。

離子排阻色譜原理

由于道南電勢的存在，離子交換劑中固定不擴散的離子可排斥帶同種電荷的小離子擴散進入樹脂相。被排阻的離子快速通過色譜柱，無保留或保留值很小；非離子溶質則被分配、保留并實現分離。強酸陰離子受阻于陽離子交換樹脂之外，而低電離度的弱酸分子能夠進入到樹脂內部，且通過溶質與樹脂功能團之間的極性相互作用和溶質與樹脂基體間的非極性相互作用被固定相所保留。

因此，在離子排阻色譜中溶質保留的選擇性產生于：

溶質受阻程度的不同，一般歸因于pKa差異，在不同的pH條件下物質的電離程度不同。

溶質與樹脂功能團間極性相互作用的差異。

溶質與樹脂基體間非極性相互作用的差異。

可通過調節柱溫改變電離平衡活躍程度，改善分離度。

實例分析

月旭Xtimate^® Sugar-H（7.8×300mm，5μm）分離弱酸鈣鹽和醋酸賴氨酸，流動相為稀硫酸溶液。在分離弱酸陰離子時，為了抑制電離，將陰離子轉化為游離的分子，使用稀酸作為流動相。調節流動相pH可改變分析物的電離程度即受阻程度，實現各物質的分離。

六種分析物結構如下

觀察以上結構，我們發現：此類分析物是連接不同R基團的有機酸分子R-C00H，擁有不同的pKa值，在不同的pH下呈現不同的分子-離子平衡狀態。所以我們設想通過離子排阻色譜填料，對不同結構的分析物產生的排阻情況和分配效果不同，從而達到分離，這樣的一個思路。

接下來我們嘗試不同pH流動相的分離效果

1. 流動相pH=1.99：

分析：僅分離五個峰，醋酸賴氨酸未分離。

2. 流動相pH=1.69：

分析：pH減小，在色譜柱中后四峰對應的物質質子化程度增強，電離程度減弱，低電離度的弱酸分子進入到樹脂內部被保留分配，后4個峰保留增強，醋酸賴氨酸得以分離（8.5min）。但倒數2，3峰出現重合，改變柱溫無更優結果。醋酸賴氨酸8.5min后有一定空間將后四個峰左移，可能分離后四個峰。嘗試將流動相pH調至（1.69-1.99）之間。

3. 調整流動相pH=1.85：

分析：后四個峰太靠左，需微調pH使得峰向右移。

考察更低pH時是否能極大增強保留使后四峰分離。

4-1. 調整流動相pH=1.40：

4-2. 調整流動相pH=1.57：

分析：更低pH無法達到分離目標。縱觀以上1-4結果，當降低流動相pH≦1.99時，不管pH變化為多少，后四峰保留時間均在8.5min至14min之間，僅先后次序發生改變。醋酸賴氨酸保留時間幾乎不變，處于8.5min前后。pH≦1.99時弱酸陰離子質子化程度比較大，幾乎達到極限，可供分離的調整空間無幾。需改變思路。

當pH升高時，調節各弱酸陰離子的電離平衡，保留一定的離子受阻率，峰保留減弱提前出峰，若醋酸賴氨酸保留時間仍不變，則可能使醋酸賴氨酸峰出在后四峰的出峰間隙中。

5. 調整流動相pH=2.0，柱溫50度：

分析：當pH升高時，峰保留減弱提前出峰，醋酸賴氨酸保留時間仍不變，處于8.5min，使醋酸賴氨酸峰出在后四峰的出峰間隙中的思路可行。

6. 調整流動相pH=2.5，柱溫50度：

分析：僅分離五個峰，醋酸賴氨酸未分離。

折中取流動相。

7-1. pH=2.3，柱溫50度和60度：

7-2. pH=2.35，柱溫50度和60度：

分析：倒數第二峰對流動相pH敏感，且與前后峰接近，調整空間受到限制，需改變思路。

當pH>2.0時，最末峰出峰范圍固定于9-11min。目前已知當pH升高時，其他四種物質出峰會提前，可以考慮將其他四個峰前移，使醋酸賴氨酸峰出在倒數第二的出峰位置。參考6的結果（pH=2.5，柱溫50度的分離情況），推測當pH>2.5時，前4個峰前移，醋酸賴氨酸得以與重合的倒數第二個峰分離。因倒數第二峰的出峰時間對pH敏感，只能微調pH進行嘗試。

8. 調流動相pH=2.6，柱溫50度和60度：

分析：達到預期分離情況，分離度良好。

結論：當我們真正了解離子排阻色譜分離原理后，就可以游刃有余的通過調節流動相的pH、柱溫等，來改變樣品保留地選擇性。通過改變色譜條件，調節分析物的電離活躍程度，改變離子受阻率，對各個物質進行分離。你，學會了嗎？